IPTG (ഐസോപ്രോപൈൽ-β-D-തിയോഗലാക്ടോസൈഡ്) β-ഗാലക്ടോസിഡേസ് സബ്സ്ട്രേറ്റിന്റെ ഒരു അനലോഗ് ആണ്, ഇത് വളരെ ഇൻഡക്റ്റിബിളാണ്. IPTG യുടെ ഇൻഡക്ഷൻ പ്രകാരം, ഇൻഡ്യൂസറിന് റെപ്രസ്സർ പ്രോട്ടീനുമായി ഒരു സമുച്ചയം രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയും, അങ്ങനെ റെപ്രസ്സർ പ്രോട്ടീന്റെ ഘടന മാറുന്നു, അങ്ങനെ അത് ലക്ഷ്യ ജീനുമായി സംയോജിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല, കൂടാതെ ലക്ഷ്യ ജീൻ കാര്യക്ഷമമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. അപ്പോൾ പരീക്ഷണ സമയത്ത് IPTG യുടെ സാന്ദ്രത എങ്ങനെ നിർണ്ണയിക്കണം? വലുതാണോ നല്ലത്?
ആദ്യം, IPTG ഇൻഡക്ഷന്റെ തത്വം നമുക്ക് മനസ്സിലാക്കാം: ഇ. കോളിയുടെ ലാക്ടോസ് ഓപ്പറോൺ (മൂലകം) മൂന്ന് ഘടനാപരമായ ജീനുകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു, Z,Y, A എന്നിവ യഥാക്രമം β-ഗാലക്റ്റോസിഡേസ്, പെർമീസ്, അസറ്റൈൽട്രാൻസ്ഫെറേസ് എന്നിവ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു. ലാക്സെഡ് ലാക്റ്റോസിനെ ഗ്ലൂക്കോസ്, ഗാലക്റ്റോസ് അല്ലെങ്കിൽ അലോ-ലാക്ടോസ് ആക്കി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുന്നു; പരിസ്ഥിതിയിലെ ലാക്ടോസിനെ കോശ സ്തരത്തിലൂടെ കടന്നുപോകാനും കോശത്തിലേക്ക് പ്രവേശിക്കാനും ലാക്വെ അനുവദിക്കുന്നു; അസറ്റൈൽ ഗ്രൂപ്പിനെ അസറ്റൈൽ-CoA യിൽ നിന്ന് β-ഗാലക്റ്റോസൈഡിലേക്ക് ലാക്എ മാറ്റുന്നു, ഇതിൽ വിഷ പ്രഭാവം നീക്കംചെയ്യുന്നു. കൂടാതെ, ഒരു പ്രവർത്തന ശ്രേണി O, ഒരു ആരംഭ ശ്രേണി P, ഒരു നിയന്ത്രണ ജീൻ I എന്നിവയുണ്ട്. I ജീൻ കോഡ് ഒരു റിപ്രസ്സർ പ്രോട്ടീനാണ്, അത് ഓപ്പറേറ്റർ ശ്രേണിയുടെ O സ്ഥാനവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, അങ്ങനെ ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) അടിച്ചമർത്തപ്പെടുകയും ഓഫാക്കപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു. ഇനിഷ്യേറ്റിംഗ് സീക്വൻസ് പി യുടെ മുകളിലായി കാറ്റബോളിക് ജീൻ ആക്റ്റിവേറ്റർ പ്രോട്ടീൻ-സിഎപി ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിനായി ഒരു ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റും ഉണ്ട്. പി സീക്വൻസ്, ഒ സീക്വൻസ്, സിഎപി ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റ് എന്നിവ ഒരുമിച്ച് ലാക് ഓപ്പറോണിന്റെ റെഗുലേറ്ററി മേഖലയെ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു. ജീൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഏകോപിത എക്സ്പ്രഷൻ നേടുന്നതിന് മൂന്ന് എൻസൈമുകളുടെയും കോഡിംഗ് ജീനുകൾ ഒരേ റെഗുലേറ്ററി മേഖലയാൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു.
ലാക്ടോസിന്റെ അഭാവത്തിൽ, ലാക് ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) അടിച്ചമർത്തൽ അവസ്ഥയിലാണ്. ഈ സമയത്ത്, PI പ്രൊമോട്ടർ സീക്വൻസിന്റെ നിയന്ത്രണത്തിലുള്ള I സീക്വൻസ് പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ലാക് റീപ്രസ്സർ O സീക്വൻസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് RNA പോളിമറേസിനെ P സീക്വൻസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് തടയുകയും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആരംഭത്തെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു; ലാക്ടോസ് ഉള്ളപ്പോൾ, ലാക് ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. ഈ ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) സിസ്റ്റത്തിൽ, യഥാർത്ഥ ഇൻഡ്യൂസർ ലാക്ടോസ് തന്നെയല്ല. ലാക്ടോസ് കോശത്തിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുകയും β-ഗാലക്റ്റോസിഡേസ് ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും അലോലാക്റ്റോസായി പരിവർത്തനം ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു. രണ്ടാമത്തേത്, ഒരു ഇൻഡ്യൂസർ തന്മാത്രയായി, റിപ്രസ്സർ പ്രോട്ടീനുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും പ്രോട്ടീൻ കോൺഫോർമേഷൻ മാറ്റുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് O സീക്വൻസും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും മുതൽ റിപ്രസ്സർ പ്രോട്ടീന്റെ വിഘടനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. ഐസോപ്രോപൈൽത്തിയോഗലാക്ടോസൈഡിന് (IPTG) അലോലാക്റ്റോസിന്റെ അതേ ഫലമുണ്ട്. ഇത് വളരെ ശക്തമായ ഒരു ഇൻഡ്യൂസറാണ്, ഇത് ബാക്ടീരിയകളാൽ മെറ്റബോളിസീകരിക്കപ്പെടുന്നില്ല, വളരെ സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്, അതിനാൽ ഇത് ലബോറട്ടറികളിൽ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ഐ.പി.ടി.ജിയുടെ ഒപ്റ്റിമൽ സാന്ദ്രത എങ്ങനെ നിർണ്ണയിക്കും? ഉദാഹരണത്തിന് ഇ.കോളി എടുക്കുക.
പോസിറ്റീവ് റീകോമ്പിനന്റ് pGEX (CGRP/msCT) അടങ്ങിയ ജനിതകമായി എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്ത E. coli BL21 സ്ട്രെയിനിനെ 50μg·mL-1 Amp അടങ്ങിയ LB ലിക്വിഡ് മീഡിയത്തിലേക്ക് കുത്തിവച്ചു, രാത്രി മുഴുവൻ 37°C ൽ കൾച്ചർ ചെയ്തു. എക്സ്പാൻഷൻ കൾച്ചറിനായി 1:100 എന്ന അനുപാതത്തിൽ 50μg·mL-1 Amp അടങ്ങിയ 50mL ഫ്രഷ് LB ലിക്വിഡ് മീഡിയത്തിന്റെ 10 കുപ്പികളിലേക്ക് മുകളിൽ പറഞ്ഞ കൾച്ചർ കുത്തിവച്ചു, OD600 മൂല്യം 0.6~0.8 ആയിരുന്നപ്പോൾ, അന്തിമ സാന്ദ്രതയിലേക്ക് IPTG ചേർത്തു. ഇത് 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ആണ്. ഒരേ താപനിലയിലും ഒരേ സമയത്തും ഇൻഡക്ഷന് ശേഷം, അതിൽ നിന്ന് 1 മില്ലി ബാക്ടീരിയൽ ലായനി എടുത്ത്, സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ബാക്ടീരിയൽ കോശങ്ങൾ ശേഖരിച്ച് SDS-PAGE ന് വിധേയമാക്കി, വ്യത്യസ്ത IPTG സാന്ദ്രതകൾ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ ചെലുത്തുന്ന സ്വാധീനം വിശകലനം ചെയ്തു, തുടർന്ന് ഏറ്റവും വലിയ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷനുള്ള IPTG സാന്ദ്രത തിരഞ്ഞെടുത്തു.
പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് ശേഷം, IPTG യുടെ സാന്ദ്രത കഴിയുന്നത്ര വലുതല്ലെന്ന് കണ്ടെത്താനാകും. കാരണം IPTG ബാക്ടീരിയകൾക്ക് ഒരു പ്രത്യേക വിഷാംശം നൽകുന്നു. സാന്ദ്രത കവിയുന്നത് കോശത്തെയും കൊല്ലും; പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, കോശത്തിൽ കൂടുതൽ ലയിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നത് നല്ലതാണെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു, എന്നാൽ പല കേസുകളിലും IPTG യുടെ സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാകുമ്പോൾ, വലിയ അളവിൽ ഉൾപ്പെടുത്തൽ രൂപപ്പെടും. ശരീരം, പക്ഷേ ലയിക്കുന്ന പ്രോട്ടീന്റെ അളവ് കുറയുന്നു. അതിനാൽ, ഏറ്റവും അനുയോജ്യമായ IPTG സാന്ദ്രത പലപ്പോഴും വലുതല്ല, മറിച്ച് സാന്ദ്രത കുറയുന്നു.
ജനിതകമായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത സ്ട്രെയിനുകളുടെ ഇൻഡക്ഷന്റെയും കൃഷിയുടെയും ലക്ഷ്യം ലക്ഷ്യ പ്രോട്ടീന്റെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെലവ് കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുക എന്നതാണ്. ലക്ഷ്യ ജീനിന്റെ പ്രകടനത്തെ സ്ട്രെയിനിന്റെ സ്വന്തം ഘടകങ്ങളും എക്സ്പ്രഷൻ പ്ലാസ്മിഡും മാത്രമല്ല, ഇൻഡ്യൂസറിന്റെ സാന്ദ്രത, ഇൻഡക്ഷൻ താപനില, ഇൻഡക്ഷൻ സമയം തുടങ്ങിയ മറ്റ് ബാഹ്യ സാഹചര്യങ്ങളും ബാധിക്കുന്നു. അതിനാൽ, പൊതുവേ, ഒരു അജ്ഞാത പ്രോട്ടീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിനും ശുദ്ധീകരിക്കുന്നതിനും മുമ്പ്, ഉചിതമായ സാഹചര്യങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിനും മികച്ച പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ നേടുന്നതിനും ഇൻഡക്ഷൻ സമയം, താപനില, IPTG സാന്ദ്രത എന്നിവ പഠിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.
പോസ്റ്റ് സമയം: ഡിസംബർ-31-2021